In vivo 항혈전작용 평가법

In vivo 항혈전작용 평가법

(Arterial Thrombosis Model Combined with bleeding time test)

Method

<실험 전 처치>

①Rat의 몸무게를 재고 쥐의 무게에 맞춰서 마취제를 투여한다

(pentobarbital Na 60 ㎎/㎏을 복강 주사) -마취가 다 될 때 까지 기다린다.

1) Rat을 종이테이프로 실험대에 고정하고 어깨선이 이어지는 목 부근을 절개한다(실험동안 열 발생 lamp를 이용하여 Rat의 체온이 37±0.5℃가 유지되도록 한다).

2) Tracheotomy(기관절개)를 실시한다 (기도 확보).

3) 가위로 작게 절개한 후 그 다음부터는 두 개의 forcep을 이용하여 근육을 찢어 들어가면서 좌측 경동맥을 조심스럽게 노출시킨다.

4) 혈관에 붙은 지방 조직을 제거하고 혈관 양끝을 둘러싼 근육을 더 절개하여 작은 핀셋을 혈관 밑에 넣어 고정시킨다 (핀셋을 끼운 상태에서도 혈관이 눌리지 않게 한다).

5) 약물 i.v.(정맥주사) 투여를 위해 우측 jugular vein을 cannulation 한다.

6) 좌경동맥의 혈관 아래에 parafilm( 1×3 ㎝)를 위치시킨다 (flow probe를 고정하는 역할).

7) saline으로 혈관을 세척한 후 probe를 끼운다 (위치?).

8) Transonic flow probe를 경동맥에 끼운 후 Transonic 속도계와 연결하고 혈류측정기에 혈류가 제대로 모니터링 되는지 확인한다.

9) FeCl2를 놓을 곳과 probe 사이에 filter를 둘둘 말아서 혈관 위에 놓는다( FeCl2로 인하여 생긴 혈전 probe와 닿는 것을 방지)

10) filter paper(Whatman No.1) disc( 2×3 ㎜) 를 40% FeCl2 용액에 흠뻑적신다.

11) filter paper disc를 probe의 하행방향에서 혈관 윗부분에 부착하며, 이때부터 recoding을 해주고 10분 후에 filter를 제거한다.

12) FeCl2 적용 후 60분 동안 유량계를 통해 경동맥의 carotid patency(개방상태)를 지속적으로 모니터 한다(PO, RF, PP).

13) 실험 후 혈관 clamp를 이용하여 혈관 조각을 분리: 혈관의 혈전을 긁어내어 무게를 잰다.

<i.v.>

마취제+수술(안정화)	15min	10min
	15min	60min

*15min 후 FeCl2를 최초 적용하고 바로 지속용량을 투여하여 60min간 관찰하도록 한다. 실제로 사용되는 혈류측정 속도는 FeCl2 적용 후 60min간 기록한다.

 

<p.o>

0.5, 1, 2, 4 hour

 

2. Bleeding time test

**Rat의 꼬리를 자르는 시점: Rat의 꼬리 말단으로부터 3㎜ 지점을 FeCl2 적용 5 min 후.

Data anaylsis

o Arterial thrombosis model

Treatment (n=3), i.v.	Classification			TTO (min)	Thrombus weight (㎎)
	PO	RF	PP
saline(n=3)
시료A :0.3㎎/㎏+(1㎍/㎏/minute)
시료A :1㎎/㎏+(3㎍/㎏/minute)
시료A :3㎎/㎏+(10㎍/㎏/minute)

1) PO, RF, PP, TTO, Thrombus weight

PO (persistent occlusion): no reflow after occulsion

RF (reflow): reflow or cyclic reflow after occlusion

PP (persistent patency): persistent flow without occlusion after initial flow

 

compound	ID30 and ID50	BT2	The ratio of BT2/ID50
Asprin (㎎/㎏+㎍/㎏/minute)

2) 혈전무게 감소효과에 대한 ID30 & ID50 (versus vehicle group), BT2 & Ratio

 

3) 개별 동물의 carotid artery 개방상태에 대한 (엑셀) 도표분석 (FeCl2 적용후 60분간)

 

o Bleeding time test model

Bleeding time(BT):Whatman No.2 여과지에 15 sec 간격으로 15 분까지 꼬리의 혈흔을 찍음으로써 측정한다. 15 분 초과하는 BT 는 15 분으로 기록함

1) BT2: vehicle 군의 BT을 2배로 증가시키는 약물의 농도

2) Bleeding time factor: ratio of BT in drug-treated group over BT in vehicle group

 

Materials and Reagents

1) Pentobarbital sodium salt(in saline) 60㎎/㎏ (i.p.)

용액	용 량
HCl	100㎖	10㎖	5㎖	1㎖
FeCl2	40g	4g	2g	0.4g(400㎎)

2) 40% FeCl2 in 1N HCl

**e-tube에 FeCl2를 넣고 filter paper 조각을 넣어 흠뻑 적신다.

40% FeCl2 (in HCl): 40g/100㎖ 비율로 조제하고 FeCl2가 분말이 아니라 고체 덩어리이므로 작게 쪼개서 저울로 무게를 재고 앞의 비율로 가할 1N HCl을 계산하여 가한다.

3) Whatman filter paper (No.1) disk: 2x3 mm (FeCl2 soaking); No.2 (blood blotting)

4) Parafilm 조각 (1x3 cm)

4) Positive control: Aspirin(Acetyl salicylate) & Argatroban

5) Sample & positive standard 용량

시약	투여방법	Loading (㎎/2㎖/㎏)	유지량(?㎍/33㎕/㎏/minute)
Sample Aspirin	i.v.	0.3	＋	0.3mg/㎏/h (5㎍/kg/min)
		1		1mg/㎏/h (16.7㎍/kg/min)
		3		3mg/㎏/h (50㎍/kg/min)
	p.o.	1
		3
		10, 30, 100

(warfarin: 0.1, 0.3, 1 mg/kg/2ml, p.o.)