주름개선 in vitro 효능평가

1. 세포주 및 세포배양

실험에 사용한 HaCat 세포는 ATCC으로 부터 분양받았으며, 100 units/ml penicilin/streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.

 

3. MTT assay

HaCat 세포를 5x105cells/ml로 96 well에 분주하고 24시간 동안 안정화 시킨다. 시료를 농도별로 처리하고 24시간 동안 CO2 배양기에 배양하였다. 배양 후 MTT(0.5 mg/ml) 용액을 처리하고 4시간 동안 CO2 배양한 후 DMSO를 넣고 30분동안 37℃에서 방치한 후 540 nm 파장에서 마이크로 스펙트로 포토미터(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 분석하였다.

 

4. Elastase 저해 활성 측정

피부 주름 개선 효과를 알아보기 위하여, elastase 저해활성을 측정하였다. 시료를 0.2M Tris-HCl buffer (pH8.0)에 10, 100, 500, 1000 μg/mL로 희석하여 96well plate에 60 μL씩 넣고, 0.8M N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilise (Sigma, USA) 20 μL를 첨가하였다. 이것을 상온에서 10분간 방치하고, 1 μg/mL의 porcine pancreatic elastase 1형 또는 4형 (Sigma, USA) 을 20 μL첨가하여 37℃에서 30분간 방치 후 ice에서 반응을 정지 시키고, 405 nm 파장에서 마이크로 스펙트로 포토미터(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다. 대조군으로는 시료 대신 증류수를 넣어 효소의 활성을 측정 하였다.

Elastase 저해활성 (%) =｛1-(S-B)/C｝X 100

S: 효소액 및 시료용액 첨가 흡광도

B: 효소액 대신 buffer 첨가 흡광도

C: 시료용액 대신 buffer첨가 흡광도

 

5. RT-PCR

HaCat 세포를 6 well plate에 5×105cells/ml 분주한 후 배양한다. 24시간 후 시료를 1시간 동안 처리하고 α-MSH를 넣어준 후 24시간 배양한다. Trizol_ Reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 을 사용하여 mRNA를 추출한 후 PrimeScript_ RT reagent kit (TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 증폭을 위하여 PCR-PreMix (Bioneer, Korea)를 사용하였다. 95℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 30초로 모두 26 cycle 반복하였고, 1% agarose gel에서 전기영동 하였다. PCR에 사용된 primer 는 Tabel2와 같다.

 

Table 2. Oligonucleotide primers used for PCR in this study.

Target gene		PCR primer sequence(5' to 3')	Expected size
hMMP-1	sense	AGC GTG TGA CAG TAA GCT AA	327bp
	antisense	GTT TTC CTC AGA AAG AGC AGC AT
hMMP-3	sense	CTT TCC TGG CAT CCC GAA GT	252bp
	antisense	GCA TAG GCA TGG GCC AAA AC
hMMP-9	sense	GTG CTG GGC TGC TGC TTT GCT G	303bp
	antisense	GTC GCC CTC AAA GGT TTF GAA T
hβ-actin	sense	CAA GAG ATG GCC ACG GCT GCT	274bp
	antisense	TCC TTC TGC ATC CTG TCG GCA