미백 in vitro 효능평가

1. 세포주 및 세포배양

실험에 사용한 B16/F10 세포는 한국세포주은행 (KTCC, Seoul, Korea)에서 분양 받았으며, 100 units/ml penicilin/streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.

 

3. MTT assay

B16/F10 세포를 5x105cells/ml로 96 well에 분주하고 24시간 동안 안정화 시킨다. 시료를 농도별로 처리하고 24시간 동안 CO2 배양기에 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-Dimethylithiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, 0.5 mg/ml) (Sigma, USA) 용액을 처리하고 4시간 동안 CO2 배양한 후 DMSO를 넣고 30분동안 37℃에서 방치한 후 540 nm 파장에서 마이크로 스펙트로 포토미터(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 분석하였다.

 

4. Tyrosinase 저해 활성 측정

시료의 tyrosinase 저해 활성 효과는 L-DAPA를 이용하여 확인하였다. 10 mM L-3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) (Sigma, USA) 를 sodium phosphate buffer (0.1M pH6.8)에 희석하여 실험에 사용하였고, mushroom tyrosinase (Sigma, USA)는 40 unit/mL의 농도로 사용하였다. 시료를 10, 100, 500, 1000 μg/mL로 sodium phosphate buffer에 희석하여 96well plate에 60 μL씩 넣고, 여기에 L-DAPA 20 μL와 mushroom tyrosinase 20 μL를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 492 nm 파장에서 마이크로 스펙트로 포토미터(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다. 대조군으로는 시료 대신 증류수를 넣어 효소의 활성을 측정 하였다.

 

Tyrosinase 저해율 (%) =｛1-(S-B)/C｝X 100

S: 효소액 및 시료용액 첨가 흡광도

B: 효소액 대신 buffer 첨가 흡광도

C: 시료용액 대신 buffer첨가 흡광도

 

5. RT-PCR

B16F10 세포를 6 well plate에 5×105cells/ml 분주한 후 배양한다. 24시간 후 시료를 1시간 동안 처리하고 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH) (Sigma, USA) 를 넣어준 후 24시간 배양한다. Trizol_ Reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 을 사용하여 mRNA를 추출한 후 PrimeScript_ RT reagent kit (TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 증폭을 위하여 PCR-PreMix (Bioneer, Korea)를 사용하였다. 95℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 30초로 모두 26 cycle 반복하였고, 1% agarose gel에서 전기영동 하였다. PCR에 사용된 primer 는 Tabel1과 같다.

 

Table 1. Oligonucleotide primers used for PCR in this study.

Target gene		PCR primer sequence(5' to 3')	Expected size
mTRP1	sense	TGG GAA AAA CGT CTG CGA TG	263bp
	antisense	CAC GGA CCT CCA AGC ACT GA
mTRP2(F)	sense	GCC CCG ACT GTA ATC GGA AG	410bp
	antisense	CTT CCC GGT TGC AAA GTT CC
mGAPDH (F)	sense	TGA CCA CAG TCC ATG CCA TC	493bp
	antisense	TTA CTC CTT GGA GGC CAT GT